~~NOTOC~~ ====== Программа обучения ====== Пожалуйста, обратите внимание, что обучение проводиться только для пользователей ЦКП "Геномика". \\ \\ \\ {{:sequest:coop:program.doc|}} Программа курса стажировки специалистов и обучения основам анализа продуктов реакции Сэнгера и фрагментного анализа на генетических анализаторах ABI PRISM 3130 Avant производства фирмы Applied Biosystems. \\ ===== Основы пробоподготовки для анализа на автоматических генных анализаторах фирмы Applied Biosystems ===== \\ == Полимеразная цепная реакция == * Основы теории и оптимизации ПЦР в приложении к секвенированию. Компоненты реакционной смеси их расход. Кинетика реакции, понятие о плато и оптимуме условий. * Поставить ПЦР на градиентном амплификаторе для подбора оптимальных условий == Очистка ДНК-матрицы (плазмиды) перед проведением реакции Сэнгера == * Наиболее частые загрязнения р-ров плазмид и ПЦР реакций. Влияние этих загрязнений на течение реакции Сэнгера (кратко). Методы очистки матрицы перед реакцией Сэнгера (ферментативные, переосаждение, сорбция, гельфильтрация). Их достоинства и недостатки * Очистка плазмиды для реакции Сэнгера: обработка РНКазой и гельфильтрация на колонках Centricep или G100 * Ответы на вопросы == Секвенирование == * Заливка агарозного геля и электрофорез продуктов ПЦР с градиентного амплификатора. Анализ результатов и выбор оптимальных условий. * Поставить препаративную ПЦР по оптимальным условиям * Особенности очистки ампликонов перед реакцией Сэнгера * Реакция Сэнгера: краткая теория * Очистка ампликонов на колонках GFX * Постановка реакции Сэнгера ===== Анализ результатов секвенирования. Фрагментный анализ. ===== Иллюстрации: диски к приборам, показательные файлы секвенирования Протоколы: ПЦР с меченными праймерами \\ == Анализ результатов секвенирования == Теория и практика совмещены на полученных последовательностях * Сырые данные (Raw Data). * Восстановление нуклеотидной последовательности (basecalling). Понятие спейсинга. Специальные и адаптивные подпрограммы * Протоколы SeqAn v. 5.x. Автоматическое определение границ обсчитываемой области, критерий качества (Qv), смешанные основания. * Интерпретация результатов и анализ их достоверности (средняя величина сигнала, сигнал/фон, наличие солей, ингибиторов, невключившихся [F]ddNTPs, малое количество матрицы, загрязнение РНК, загрязнение вторым праймером, «-1» праймер, продуктами деградации праймера, негомогенная матрица, мутации.) * Ручная корректировка параметров обсчёта (границы, спейсинг, подпрограмма, «внутренние имена»). * Служебная информация в файлах *.abi, *.ab1. * Альтернативное ПО для просмотра результатов. == Фрагментный анализ == * Основной принцип. Внутренние стандарты длин. Метка: праймер или [F]dNTP. Чем лучше праймер (мечение одной цепи, известный заряд-подвижность, нет необходимости в очистке). Требования к полимеразе, варианты оптимизации * ПЦР на STR и VNTR повторы PAH c 5’(5,6)FAM праймерами * ПЦР с меченным праймером. Необходимость многократного разбавления: минимальные затраты не реактивы, нет необходимости в очистке) * Подбор условий нанесения. Динамический диапазон. Оценка полноты реакции. Конкуренция между стандартом и исследуемыми фрагментами и солями. Редактирование модулей. * Нанесение продуктов ПЦР с меченными праймерами на генные анализаторы для проведения фрагментного анализа * Денатурирующие и неденатурирующие условия фореза. Разница в разрешении и возможности деления цепей. Особенности фирменных стандартов длин в зависимости от типа (меченые по одной или двум цепям) в денатурирующих и неденатурирующих условиях. Варианты нанесения из воды и формамида на те и другие полимеры. * Каналы детекции и виртуальные фильтры. * Стандарты длин. Собственные и фирменные. Особенности стандартов длин в зависимости от типа (меченые по одной или двум цепям) в денатурирующих и неденатурирующих условиях. Аномальная подвижность фрагментов. ===== Фрагментный анализ: интерпретация результатов ===== Иллюстрации: диски к приборам, показательные файлы секвенирования, ноябрьский опыт \\ == Фрагментный анализ: интерпретация результатов == * Сырые данные. (Raw Data). * Анализ в программах Gene Mapper и Peak Scanner. Параметры обсчёта. Алгоритмы определения размеров. Принципиальная относительность полученных размеров. * Основные проблемы при обсчёте (аномальная подвижность фргментов, оценка полноты протекания реакции, эффективность протекания реакции, безматричный синтез «А», «проскальзывание полимеразы». * Альтернативное ПО для просмотра результатов. == Работа с современными системами гель-документации == * Особенности систем гель-документации на примере системы Bio-Rad Gel-Doc. Основное программное обеспечение. Использование программного обеспечения сторонних производителей для конкретных задач. ===== Дополнительный контроль усвоенного материала и самостоятельная работа ===== * Повторение основных протоколов. Обсуждение вопросов, возникших на базе полученных знаний. Самостоятельная практическая работа с приборами и анализ полученных данных.