Программа обучения

Пожалуйста, обратите внимание, что обучение проводиться только для пользователей ЦКП «Геномика».

program.doc Программа курса стажировки специалистов и обучения основам анализа продуктов реакции Сэнгера и фрагментного анализа на генетических анализаторах ABI PRISM 3130 Avant производства фирмы Applied Biosystems.

• Основы теории и оптимизации ПЦР в приложении к секвенированию. Компоненты реакционной смеси их расход. Кинетика реакции, понятие о плато и оптимуме условий.
• Поставить ПЦР на градиентном амплификаторе для подбора оптимальных условий

• Наиболее частые загрязнения р-ров плазмид и ПЦР реакций. Влияние этих загрязнений на течение реакции Сэнгера (кратко). Методы очистки матрицы перед реакцией Сэнгера (ферментативные, переосаждение, сорбция, гельфильтрация). Их достоинства и недостатки
• Очистка плазмиды для реакции Сэнгера: обработка РНКазой и гельфильтрация на колонках Centricep или G100
• Ответы на вопросы

• Заливка агарозного геля и электрофорез продуктов ПЦР с градиентного амплификатора. Анализ результатов и выбор оптимальных условий.
• Поставить препаративную ПЦР по оптимальным условиям
• Особенности очистки ампликонов перед реакцией Сэнгера
• Реакция Сэнгера: краткая теория
• Очистка ампликонов на колонках GFX
• Постановка реакции Сэнгера

Иллюстрации: диски к приборам, показательные файлы секвенирования

Протоколы: ПЦР с меченными праймерами

Теория и практика совмещены на полученных последовательностях

• Сырые данные (Raw Data).
• Восстановление нуклеотидной последовательности (basecalling). Понятие спейсинга. Специальные и адаптивные подпрограммы
• Протоколы SeqAn v. 5.x. Автоматическое определение границ обсчитываемой области, критерий качества (Qv), смешанные основания.
• Интерпретация результатов и анализ их достоверности (средняя величина сигнала, сигнал/фон, наличие солей, ингибиторов, невключившихся [F]ddNTPs, малое количество матрицы, загрязнение РНК, загрязнение вторым праймером, «-1» праймер, продуктами деградации праймера, негомогенная матрица, мутации.)
• Ручная корректировка параметров обсчёта (границы, спейсинг, подпрограмма, «внутренние имена»).
• Служебная информация в файлах *.abi, *.ab1.
• Альтернативное ПО для просмотра результатов.

• Основной принцип. Внутренние стандарты длин. Метка: праймер или [F]dNTP. Чем лучше праймер (мечение одной цепи, известный заряд-подвижность, нет необходимости в очистке). Требования к полимеразе, варианты оптимизации
• ПЦР на STR и VNTR повторы PAH c 5’(5,6)FAM праймерами
• ПЦР с меченным праймером. Необходимость многократного разбавления: минимальные затраты не реактивы, нет необходимости в очистке)
• Подбор условий нанесения. Динамический диапазон. Оценка полноты реакции. Конкуренция между стандартом и исследуемыми фрагментами и солями. Редактирование модулей.
• Нанесение продуктов ПЦР с меченными праймерами на генные анализаторы для проведения фрагментного анализа
• Денатурирующие и неденатурирующие условия фореза. Разница в разрешении и возможности деления цепей. Особенности фирменных стандартов длин в зависимости от типа (меченые по одной или двум цепям) в денатурирующих и неденатурирующих условиях. Варианты нанесения из воды и формамида на те и другие полимеры.
• Каналы детекции и виртуальные фильтры.
• Стандарты длин. Собственные и фирменные. Особенности стандартов длин в зависимости от типа (меченые по одной или двум цепям) в денатурирующих и неденатурирующих условиях. Аномальная подвижность фрагментов.

Иллюстрации: диски к приборам, показательные файлы секвенирования, ноябрьский опыт

• Сырые данные. (Raw Data).
• Анализ в программах Gene Mapper и Peak Scanner. Параметры обсчёта. Алгоритмы определения размеров. Принципиальная относительность полученных размеров.
• Основные проблемы при обсчёте (аномальная подвижность фргментов, оценка полноты протекания реакции, эффективность протекания реакции, безматричный синтез «А», «проскальзывание полимеразы».
• Альтернативное ПО для просмотра результатов.

• Особенности систем гель-документации на примере системы Bio-Rad Gel-Doc. Основное программное обеспечение. Использование программного обеспечения сторонних производителей для конкретных задач.

• Повторение основных протоколов. Обсуждение вопросов, возникших на базе полученных знаний. Самостоятельная практическая работа с приборами и анализ полученных данных.