====== Требования к образцам для секвенирования методом Сэнгера ====== \\ **Заказы, оформленные с нарушением настоящих требований, могут быть отклонены** ===== 1. Общие требования ===== ==== Маркировка и упаковка образцов ==== * Допускается использование стандартных пробирок объёмом 1,5 мл, 0,5 мл, 0,2 мл или стрипов 8 × 0,2 мл. * Запрещается отрезать крышки пробирок. * Количество пробирок должно соответствовать количеству образцов, указанных в бланке заказа. * Каждая пробирка должна быть промаркирована ярлыком (одна буква и две цифры), указанным в бланке заказа. Если один образец (матрица) секвенируется с двух праймеров, на пробирке необходимо указать оба ярлыка образцов. * Используйте водостойкую маркировку (например, перманентный маркер). * Пробирки и бланк заказа должны быть помещены в ZIP-пакет. * Не допускается приклеивание пробирок к бланку заказа. \\ ==== Использование 96-луночных планшетов (только по предварительному согласованию): ==== * образцы размещаются начиная с ячейки A01; * нумерация ведётся сверху вниз (A01–H01, A02–H02 и т.д.); * одна ячейка должна оставаться свободной для контрольного образца, т. е. максимальное количество образцов на планшет составляет 95. \\ \\ ===== 2. Готовые очищенные реакции Сэнгера ===== Образцы, для которых реакция секвенирования уже выполнена и проведена очистка от не включившихся красителей BigDye Terminator. \\ ==== Требования к образцам ==== * Образцы должны быть очищены от не включившихся красителей BigDye Terminator (BDT). * После очистки образцы должны быть полностью высушены. Осадок должен находиться на дне пробирки и не быть визуально различимым. \\ \\ ===== 3. Реакция Сэнгера с ампликонов или плазмид ===== \\ === Праймеры === Предоставьте праймеры (18–30 нт): * либо в виде раствора 10 мкМ (по 2 мкл на одну реакцию); * либо в виде стокового раствора с указанием концентрации. \\ === Рекомендуемое количество матрицы ДНК === * Для одной реакции секвенирования необходимо предоставить **__300-500 фемтомоль__** матрицы. * При использовании нескольких праймеров количество ДНК следует увеличить пропорционально числу реакций. * Для пересчёта в массу ДНК можно использовать формулу:\\ \\ **Масса ДНК (нг) = количество (фмоль) × длина фрагмента (п.н.) × 0,00066** \\ === Плазмидная ДНК === При формировании заказа следует: * указать размер плазмиды (п.н.); * указать объем и концентрацию, измеренную на Qubit и/или Nanodrop; * привести cоотношение A260/280 (для чистой ДНК составляет 1,8–1,9. Иные значения могут указывать на наличие примесей и снижать качество секвенирования); * образец должен содержать одну плазмиду (наличие смеси нескольких плазмид может приводить к наложению последовательностей и ухудшению качества результата); * если требуется секвенирование с нескольких праймеров, предоставляется одна пробирка с матрицей, на которой указывается несколько ярлыков. * если требуется подбор праймеров, необходимо предоставить нуклеотидную последовательность плазмиды. \\ === ПЦР-продукты === == Очищенный ПЦР-продукт == * предоставить очищенный ампликон (после выделения из геля, очистки на колонках или магнитных частицах); * прислать фото результата гель-электрофореза продуктов ПЦР с маркером длин ДНК; * указать длину исследуемого фрагмента и концентрацию, измеренную на Qubit и/или Nanodrop; * если требуется секвенирование с нескольких праймеров, предоставляется одна пробирка с матрицей, на которой указывается несколько ярлыков. \\ == Неочищенный ПЦР-продукт == ЦКП может выполнить очистку ампликона перед секвенированием. * предоставить реакционную смесь ПЦР; * прислать фото результата гель-электрофореза продуктов ПЦР с маркером длин ДНК * указать объём ПЦР-смеси и ожидаемую длину ампликона. \\