Требования к образцам для секвенирования методом Сэнгера

1. Общие требования

Маркировка и упаковка образцов

• Допускается использование стандартных пробирок объёмом 1,5 мл, 0,5 мл, 0,2 мл или стрипов 8 × 0,2 мл.
• Запрещается отрезать крышки пробирок.
• Количество пробирок должно соответствовать количеству образцов, указанных в бланке заказа.
• Каждая пробирка должна быть промаркирована ярлыком (одна буква и две цифры), указанным в бланке заказа. Если один образец (матрица) секвенируется с двух праймеров, на пробирке необходимо указать оба ярлыка образцов.
• Используйте водостойкую маркировку (например, перманентный маркер).
• Пробирки и бланк заказа должны быть помещены в ZIP-пакет.
• Не допускается приклеивание пробирок к бланку заказа.

Использование 96-луночных планшетов (только по предварительному согласованию):

• образцы размещаются начиная с ячейки A01;
• нумерация ведётся сверху вниз (A01–H01, A02–H02 и т.д.);
• одна ячейка должна оставаться свободной для контрольного образца, т. е. максимальное количество образцов на планшет составляет 95.

2. Готовые очищенные реакции Сэнгера

Образцы, для которых реакция секвенирования уже выполнена и проведена очистка от не включившихся красителей BigDye Terminator.

Требования к образцам

• Образцы должны быть очищены от не включившихся красителей BigDye Terminator (BDT).
• После очистки образцы должны быть полностью высушены. Осадок должен находиться на дне пробирки и не быть визуально различимым.

3. Реакция Сэнгера с ампликонов или плазмид

Праймеры

Предоставьте праймеры (18–30 нт):

• либо в виде раствора 10 мкМ (по 2 мкл на одну реакцию);
• либо в виде стокового раствора с указанием концентрации.

Рекомендуемое количество матрицы ДНК

• Для одной реакции секвенирования необходимо предоставить 300-500 фемтомоль матрицы.
• При использовании нескольких праймеров количество ДНК следует увеличить пропорционально числу реакций.
• Для пересчёта в массу ДНК можно использовать формулу:
  

Плазмидная ДНК

При формировании заказа следует:

• указать размер плазмиды (п.н.);
• указать объем и концентрацию, измеренную на Qubit и/или Nanodrop;
• привести cоотношение A260/280 (для чистой ДНК составляет 1,8–1,9. Иные значения могут указывать на наличие примесей и снижать качество секвенирования);
• образец должен содержать одну плазмиду (наличие смеси нескольких плазмид может приводить к наложению последовательностей и ухудшению качества результата);
• если требуется секвенирование с нескольких праймеров, предоставляется одна пробирка с матрицей, на которой указывается несколько ярлыков.
• если требуется подбор праймеров, необходимо предоставить нуклеотидную последовательность плазмиды.

ПЦР-продукты

Очищенный ПЦР-продукт

• предоставить очищенный ампликон (после выделения из геля, очистки на колонках или магнитных частицах);
• прислать фото результата гель-электрофореза продуктов ПЦР с маркером длин ДНК;
• указать длину исследуемого фрагмента и концентрацию, измеренную на Qubit и/или Nanodrop;
• если требуется секвенирование с нескольких праймеров, предоставляется одна пробирка с матрицей, на которой указывается несколько ярлыков.

Неочищенный ПЦР-продукт

ЦКП может выполнить очистку ампликона перед секвенированием.

• предоставить реакционную смесь ПЦР;
• прислать фото результата гель-электрофореза продуктов ПЦР с маркером длин ДНК
• указать объём ПЦР-смеси и ожидаемую длину ампликона.