Оригинал статьи


«Наука в Сибири» от 02.02.2015 г.

«Магнитный резонанс поможет изучить рак и гепатит С»

Новосибирский институт органической химии СО РАН получил грант РНФ на исследование структуры и функций белков и нуклеиновых кислот с помощью магнитного резонанса. Результаты этой работы помогут понять молекулярные механизмы, лежащие в основе онкологии молочной железы и гепатита С, и разработать подходы к созданию новых лекарств от этих болезней, а также позволят усовершенствовать методологию научных исследований.

Проект объединил сотрудников Новосибирского института органической химии им. Н. Н. Ворожцова СО РАН, Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и Международного томографического центра СО РАН.

«Наша работа направлена на решение трёх задач: поиск молекулярной мишени в РНК вируса гепатита С, изучение структуры лактаптина (фрагмента каппа-казеина женского молока, способного вызвать гибель клеток рака молочной железы человека) и разработку новых подходов к исследованию белков и нуклеиновых кислот. Все эти темы объединены общей методологией: ядерным (ЯМР) и электронным магнитным резонансом (ЭПР)», — рассказывает руководитель проекта, в.р.и.о. директора НИОХ СО РАН доктор физико-математических наук Елена Григорьевна Багрянская.

Гепатит С и супер-злодей IRES

«Одним из перспективных приложений ЭПР-спектроскопии в молекулярной биологии является изучение пространственной организации функциональных РНК-белковых комплексов, структуру которых сложно определить другими методами, такими как рентгеноструктурный анализ или криоэлектронная микроскопия. Знания об их строении позволяют глубже понять механизмы разнообразных клеточных процессов, обеспечивающих нашу жизнедеятельность», — говорит заведующая Лабораторией структуры и функции рибосом ИХБФМ СО РАН доктор химических наук Галина Георгиевна Карпова.

РНК вируса гепатита С содержит в своем составе один специфический структурный элемент — так называемый IRES, благодаря которому вирус при проникновении в клетку подчиняет её трансляционный аппарат, чтобы синтезировать собственные белки. Он делает это путем связывания IRES с малой субчастицей рибосомы, отвечающей за начальные стадии синтеза.

Сегодня частично известны молекулярные механизмы этого процесса. В лаборатории структуры и функции рибосом показано, что связывание IRES вызывает в субчастице внутренние перестройки, благодаря которым она становится способной участвовать в инициации трансляции вирусной РНК. При этом происходят изменения и в самом IRES. То есть, его структура в изолированном виде сильно отличается от той, которую он приобретает в результате связывания с малой субчастицей рибосомы. Более того, установлены даже участки IRES, отвечающие за эти перестройки. Однако до конца этот процесс пока не понят. Прояснить его можно было бы с помощью рентгеноструктурного анализа или криоэлектронной микроскопии. Однако оба эти метода имеют свои ограничения — первый требует обязательной кристаллизации изучаемого объекта (но не все биологические структуры легко ей поддаются). Второй, хотя и достиг уже достаточно высокого уровня разрешения, не позволяет увидеть конкретные нуклеотиды рибосомной РНК и IRES, участвующие в перестройках.

«Отчасти эта проблема могла бы быть решена с помощью ЭПР-спектроскопии. Так, измеряя расстояния между различными участками IRES в составе его комплексов с малой субчастицей рибосомы и сравнивая их с расстояниями между теми же участками IRES в его изолированном состоянии, мы узнали бы, каким образом изменяется структура этого элемента на начальной стадии трансляции вирусной РНК. Такая информация, в свою очередь, дала бы нам возможность выбрать подходящие мишени для направленного воздействия на последнюю, чтобы блокировать её трансляцию на стадии инициации», — утверждает Галина Георгиевна.

Такого рода исследование требует вводить спиновые метки не в одно положение IRES, а сразу в несколько. Это нетривиальная научная задача, поскольку ни один из известных к настоящему времени подходов не позволяет внедрять их в длинные структурированные РНК, которые соответствовали бы природным РНК, или хотя бы их фрагментам.

В Лаборатории структуры и функции рибосом ИХБФМ СО РАН разработан метод сайт-направленного введения спиновых меток, позволяющий сделать это. Идея сибирских учёных такова: сначала в заданное положение РНК вводится амино-линкер — специальное ароматическое соединение, ковалентно связанное с определенным ДНК-олигомером. Последний легко удаляется, и это приводит к высвобождению амино-группы в остатке, оказавшемся присоединённым к РНК в результате её модификации. По ней затем селективно вводится необходимая метка.

Подход сибирских учёных основан на методе комплементарно-адресованного алкилирования, который был предложен около 50-ти лет назад Ниной Ивановной Гринёвой в лаборатории химии природных соединений, возглавляемой Дмитрием Георгиевичем Кнорре, которая в то время входила в состав Института органической химии АН СССР. Этот метод был придуман для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты — прежде всего, ДНК.

«Сайт-направленно вводить спиновые метки в IRES намного сложнее, чем, например, фотоактивируемые, которые используют для мечения участков рибосомы, где связываются конкретные нуклеотиды IRES. Эта сложность вызвана тем, что для измерения расстояния между различными участками IRES спиновые метки должны быть присоединены к нему одновременно по двум заданным положениям, — отмечает сотрудница ИХБФМ СО РАН кандидат химических наук Елена Сергеевна Бабайлова, непосредственно занимающаяся введением меток в IRES. — Это задача может быть решена путём последовательного комплементарно-адресованного алкилирования РНК — то есть, сначала нужно провести модификацию по одному участку, затем — по другому».


Производные, полученные таким способом, оказались пригодными для ЭПР-исследований. «Еще одной находкой проекта было то, что, в модельные РНК мы ввели спиновые метки на основе стереозамещенных нитроксильных радикалов имидазолинового ряда, синтезированные в лаборатории азотистых соединений НИОХ СО РАН кандидатом химических наук Игорем Анатольевичем Кирилюком и его коллегами. Как оказалось, эти метки имеют свойства, которые позволяют проводить изменения не при традиционных гелевых температурах, а при более высоких — до 150 К. Полученные результаты были представлены в Японии, Швейцарии и Франции в качестве пленарных докладов на международных конференциях. Учёные, занимающиеся применением ЭПР к исследованию РНК, проявили к нему огромный интерес», — отмечает Елена Григорьевна Багрянская.

Рак и добрый лактаптин

Вторая задача интеграционного проекта сибирских учёных — исследование структуры лактаптина (не так давно открытого в лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН под руководством кандидата биологических наук Владимира Александровича Рихтера фрагмента каппа-казеина молока человека, способного вызвать гибель клеток рака молочной железы) и его генно-инженерного аналога — лактаптина RL2, также показавшего эффективность в торможении опухолевых процессов. Сделать это с помощью стандартных подходов невозможно — белок не поддаётся кристаллизации — поэтому в проекте планируется применить современные методы ядерного и электронного резонанса (ЯМР и ЭПР).

«Информация о структуре лактаптина позволит понять механизм его действия на молекулярном уровне. В дальнейшем на основе полученных знаний можно будет создать эффективный противоопухолевый препарат», — утверждает научный сотрудник лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН кандидат химических наук Александр Сергеевич Фомин.

Для изучения лактаптина методом ЯМР необходимо было получить его рекомбинантный аналог, обогащённый по изотопам атомов азота N15 и углерода С13. При исследовании методом ЭПР стояла задача химически модифицировать структуру этого фрагмента, введя спиновую метку в несколько положений полипептидной цепи. На сегодняшний день учёным уже удалось получить почти все необходимые образцы. Сейчас вместе с коллегами из МТЦ СО РАН и НИОХ СО РАН они изучают спектры ЯМР лактаптина.


«Метод ЯМР позволяет исследовать белки и другие биологические объекты без введения дополнительных химических групп. Однако объем информации, содержащийся в получаемых спектрах, оказывается очень большим. Поэтому для более точной их расшифровки используют дополнительные данные о структуре белка, извлекаемые другими способами, например, ЭПР, — рассказывает сотрудник лаборатории магнитного резонанса НИОХ СО РАН кандидат химических наук Андрей Владимирович Шернюков. — Сделать это помогает методология по сайт-направленному введению спиновых меток. Сначала с её помощью измеряется расстояние между конкретными участками белка. Затем эти данные вводятся в программу молекулярного моделирования, и на выходе получается готовая структура, на основании которой можно предсказать спектр ЯМР. По нему уже гораздо проще и быстрее найти решения, и они получаются более точными». В дальнейшем учёные также планируют изучать структуру лактаптина с помощью ядерного резонанса.

Как «разговорить» белки и нуклеиновые кислоты?

Третья задача проекта — разработка новых подходов к исследованию структуры и функций белков и нуклеиновых кислот методами магнитного резонанса — ЯМР и ЭПР. Второй позволяет изучать биополимеры путём введения в них двух спиновых меток и последующим измерением расстояния между ними. Метод импульсного двойного электрон-электронного резонанса, который сегодня широко используется во всём мире, был предложен впервые в Новосибирске в Институте химической кинетики и горения им. В. В. Воеводского СО РАН А. Д. Миловым и Ю. Д. Цветковым. Однако он имеет свои недостатки, которые мешают расширить область его применения. Во-первых, этот метод не такой чувствительный, как флуоресцентная спектроскопия, а необходимо достичь условий, позволяющих работать с малыми концентрациями веществ в биологических объектах. Во-вторых, до последнего времени для измерения расстояний ЭПР применялся только в замороженных растворах. Образцы требовалось охлаждать до температуры в 80 К, лишь при таких условиях было возможно проводить измерения. Одно из направлений интеграционного проекта — придумать, как снять эти ограничения.

В лаборатории металлокомплексного катализа НИОХ СО РАН под руководством кандидата химических наук Виктора Михайловича Тормышева синтезируют новый тип спиновых меток — тритильные радикалы, которые позволяют применять ЭПР уже при комнатных температурах. «Совместно с Лабораторией бионанонотехнологии ИХБФМ СО РАН (руководитель — доктор химических наук Дмитрий Владимирович Пышный) мы впервые провели исследование по использованию этих меток на модельных ДНК-комплексах для изменения расстояний в нуклеиновых кислотах без заморозки», — рассказывает кандидат физико-математических наук Олеся Анатольевна Крумкачева, младший научных сотрудник Лаборатории магнитного резонанса МТЦ СО РАН (под руководством доктора химических наук Матвея Владимировича Федина).


Биологические объекты лучше исследовать в условиях их существования в природе. Однако из-за особенностей методики ЭПР-эксперимента раньше всегда использовали охлаждение образцов до температуры жидкого азота (- 195 °С). При этом возникал вопрос: насколько точно данные, полученные при заморозке образца, соответствуют таковым в нативных (природных) условиях? Для преодоления температурного барьера метода ЭПР учёные впервые ввели тритильные спиновые метки в структуру модельного ДНК-комплекса. Однако этого оказалось недостаточно. «Дело в том, что при температурах выше 0 °С в растворе размораживается движение молекулы спин-меченого комплекса как целого, что значительно уширяет распределение измеряемых расстояний в эксперименте, тем самым драматически снижая точность измерений. Воспользовавшись тем, что молекула ДНК имеет значительный отрицательный заряд, мы предложили подход по фиксированию спин-меченого ДНК-комплекса на поверхности положительно заряженного сорбента. Это позволило остановить ненужное вращение. Также нами было показано, что структура ДНК остаётся прежней и наличие спиновых меток не меняет её свойств», — объясняет младший научный сотрудник Лаборатории бионанотехнологии ИХБФМ СО РАН Георгий Юрьевич Шевелёв.

Этот шаг позволил измерить расстояния даже не при комнатной температуре (25 °C), а при 37 °C (физиологическая температура тела у многих живых организмов), чего раньше никто никогда не делал. Также в ходе работы над проектом учёным удалось уменьшить длину линкера – функциональной химической группы, соединяющей спиновую метку и олигонуклеотид, что позволило значительно повысить точность измерения расстояний. «Возможности метода показаны на достаточно простой модели, однако они открывают широкие перспективы для изучения структуры сложных супрамолекулярных комплексов белковой и белково-нуклеиновой природы»,— рассказывает Георгий.

Однако поскольку использование положительно заряженного сорбента может оказаться не очень эффективным для исследования реальных биологических объектов, так как есть вероятность, что при контакте с его поверхностью их структура может быть искажена, в проекте запланированы поиски других способов иммобилизации спин-меченых ДНК-комплексов. Возникла идея использовать для этих целей молекулу дисахарида — трегалозу. Если добавить в её насыщенный водный раствор спин-меченый ДНК-комплекс и испарить избытки воды, получается сухой порошок, который, как выяснилось, обладает
свойством защищать помещенный в него объект от полного обезвоживания Таким образом, трегалоза выступает как вещество-протектор, с одной стороны, обеспечивающий иммобилизацию биологического объекта, а с другой — сохраняющий его природную структуру. Также она позволяет измерять расстояния в спин-меченых ДНК-комплексах при комнатной температуре, что особенно важно в контексте будущих структурных ЯМР и ЭПР исследований сложных белково-нуклеиновых комплексов.

«За прошедший год работы над проектом нашей группой получены очень важные результаты, и еще более интересные ожидаются в будущем. В значительной степени это обусловлено одним из главных преимуществ Академгородка — возможностью проводить междисциплинарные исследования и объединять ученых разных специальностей и институтов для решения конкретных научных задач», — отмечает Елена Багрянская.










Диана Хомякова