Оригинал статьи

РИА Сибирь от 05.04.2016 г.

Сибирские ученые разработали биолюминесцентный зонд для определения вирусов

Ученые из Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск) совместно с коллегами из Института биофизики СО РАН (Красноярск) создали биосенсор, способный распознавать клещевой энцефалит.

Биолюминесцентный зонд представляет собой рекомбинантный белок, состоящий из двух частей. Одна связывается с вирусом, а вторая служит сигнальной молекулой, которая и позволяет выявить его наличие.

«Первый фрагмент биосенсора - это вариабельный домен специфичных моноклональных антител, который контактирует непосредственно с белком вируса.Второй - люминесцентный белок (люцифераза), полученный в Институте биофизики», - поясняет старший научный сотрудник Института химической биологии и фундаментальной медицины, кандидат биологических наук Вера Морозова.

«Упомянутая люцифераза (в данном случае - мягкого коралла Renilla muelleri) - небольшой одноцепочечный белок, она была клонирована в нашей лаборатории фотобиологии, и в нее мы ввели 7 мутаций, в результате которых существенно увеличилась стабильность фермента», - поясняет ведущий научный сотрудник Института биофизики, доктор биологических наук Людмила Франк.

Известно, что квантовый выход у биолюминесцентных реакций (катализируемых специфическими ферментами - люциферазами) намного выше, чем у обычных хемилюминесцентных (свечение, сопровождающее некоторые химические процессы - прим. ред.) реакций. То есть, количество света, испускаемое в результате люциферазных реакций больше, и таким образом, люциферазы, используемые как сигнальные молекулы, позволяют выявлять мишени с более высокой чувствительностью.

Обе составляющих соединяются с помощью методов генной инженерии, в результате получается плазмида - генетическая конструкция, содержащая объединенные гены двух белков. Затем она помещается в бактериальные клетки, в которых синтезируется гибридный, достаточно стабильный искусственный белок - его можно выделить из клеток и работать с ним далее.

«Технически весь процесс тестирования выглядит так: берется клещ, размалывается, из него экстрагируется водная часть, которая, может содержать вирус, далее водная суспензия вносится в ячейки, содержащие антитела, - объясняет младший научный сотрудник Института химической биологии и фундаментальной медицины, кандидат химических наук Иван Байков. - В случае, когда последние связали вирус клещевого энцефалита, происходит его накопление, что затем выявляется добавлением биолюминисцентного зонда и последующей химической реакцией люминесценции. Если вируса клещевого энцефалита нет, то антитела остаются пустые, сигнала не будет».

Выявить клещевой энцефалит в крови сложнее, он присутствует там недолго, а потом проникает в нервную систему, так что основное применение зонда - экспресс-проверка клещей, переносящих заболевание.

Если говорить об аппаратной части, то для выполнения анализов необходим люминометр, с помощью которого регистрируются кванты излучения от люциферазной части биосенсора.

Ученые проверили клещей, предварительно зараженных вирусом с определенным титром одновременно в коммерческих тест-системах и с помощью созданного зонда. «Преимущество этой разработки - более высокая чувствительность, она позволяет выявить даже незначительное количество вируса клещевого энцефалита, - отмечает Иван Байков. - Для внедрения в практику нам нужно провести еще ряд экспериментов, выявить, какие примеси могут мешать, оптимизировать протокол пробоподготовки и непосредственно прототип тест-системы».

По такому же принципу можно разрабатывать зонды и для детекции других вирусов: точно так же взять нужное антитело и объединить по уже известной технологии с биолюминисцентным белком.

«Это касается и бактериальных или грибных агентов, - комментирует Вера Морозова. - Сейчас мы пытаемся получить тест-системы на выявление патогенных грибов, часто встречающихся у иммуносупрессивных пациентов».



Из еженедельника «Наука в Сибири».