Биомолекула

от 10.01.2023 г.

Оригинал статьи


Как создаются лекарства, или по вирусу — прямой наводкой



Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Население Земли за последние столетия стремительно выросло, достигнув 8 миллиардов под конец 2022 года. Во многом это произошло благодаря успехам медицины — в частности, открытию в середине прошлого века антибиотиков, спасших миллионы жизней. Но чем больше нас становится, чем шире мы распространяемся по планете, тем выше вероятность встречи с новыми инфекционными агентами, вирусами, бактериями и грибами. И если в борьбе с бактериями мы пока что выигрываем (хотя поиск новых антибиотиков становится всё более долгим и дорогим), то бороться с вирусными инфекциями человечество еще только учится, больше полагаясь на профилактическую вакцинацию. Мы предлагаем читателю проследить, как создаются лекарства прямого действия против вирусов — «полуживых» паразитов человека, в том числе — на примере разработки специфического препарата против коронавирусных инфекций.

Конкурс «Био/Мол/Текст»-2022/202399

Эта работа опубликована в номинации «Своя работа» конкурса «Био/Мол/Текст»-2022/2023.

Хеликон

Партнер номинации — компания «Хеликон»: — один из ведущих российских поставщиков продукции и услуг для молекулярно-биологических и клеточных лабораторий.

«Альпина нон-фикшн»

«Книжный» спонсор конкурса — «Альпина нон-фикшн»

Эволюционная теория утверждает, что выживает организм, наиболее приспособленный к окружающей среде. Теория вероятностей добавляет: «или тот, кому повезет». Тем не менее, выжить стремится любой организм, хотя это лишь цель, не причина.

Вспомним, что на заре зарождения жизни существовали лишь отдельные молекулы в различных водоемах Земли — «первичных бульонах» [1]. И когда некоторые из них научились создавать себе подобных [2], то они и стали «выживать» лучше других просто потому, что их становилось больше, и с физической точки зрения это было энергетически выгодно. То есть причин (в бытовом смысле этого слова) для выживания у них и не было. С тех пор минули миллиарды лет эволюции живого, но основы мира не изменились.

Человеку очень полезно знать эти основы: как осуществляются взаимоотношения между различными биологическими видами, населяющими нашу планету; и какую выгоду из них он может извлечь. Понимать, какое положение занимает он сам, какую опасность могут представлять для него отдельные организмы и как с ними можно бороться.

В широком смысле, один организм может представлять опасность для другого, если он затрудняет его выживание. И речь идет не о счастливой жизни до глубокой старости, а о производстве как можно большего числа плодовитого потомства. В этом смысле опасность есть всегда, когда есть конкуренция за ресурсы, которая снижает вероятность успешно размножиться.

Можно выделить три класса взаимоотношений, при которых один вид снижает шансы на выживание другого. По сути, они напрямую связаны со способами питания: хищничество — прямое истребление одного вида другим, для которого он является пищей; конкуренция за ресурсы в узком смысле, возникающая, когда два вида одинаковой пищевой специализации живут на одной территории; паразитизм — непосредственная «кража» полезных ресурсов у другого вида, которые он производит для себя. Во всех этих случаях гибель какого-либо из организмов является побочным эффектом стремления выжить другого организма, как бы это цинично ни звучало в случае хищников.

Особым подклассом паразитов являются инфекционные агенты, которые приспособлены для жизни исключительно внутри другого организма (хозяина) и не могут выживать вне него. Некоторые виды паразитов могут годами жить внутри других организмов, не вызывая у хозяина серьезных патологических симптомов. Но подавляющее большинство, даже долгоживущие, не только крадет полезные ресурсы хозяина, но и выделяет вещества, негативно влияющие на его здоровье. А некоторые настолько полно «используют» своего носителя, что у того не хватает ресурсов для себя, и его жизненные функции быстро угасают.

Таким образом, именно конкурентная борьба за ресурсы организма между самим организмом и инфекционными агентами является основной причиной и спецификой инфекционных заболеваний.

Инфекции и как с ними бороться

Инфекционные заболевания обычно классифицируют по месту распространения возбудителя — общие или местные — и по его виду — многоклеточные, одноклеточные, вирусы и прионы. Первое деление важно в основном для выбора способа введения лекарства: местно или вовнутрь, чтобы через кровь оно распространилось по всему организму с прицелом (или без) на определенные органы. Но чтобы понять, какое действующее вещество выбрать, в первую очередь нужно узнать, с каким врагом мы боремся. И в этом смысле самая важная граница проходит между живыми и неживыми инфекционными агентами, т. е. между клеточными организмами и неклеточными молекулярными структурами, каковыми являются вирусы и прионы.

Прионы [3] представляют собой одиночные белковые молекулы, которые обладают способностью «переделывать» клеточные белки по своему «образу и подобию». Тем самым они «размножаются», запуская в клетках каскад накопления белковой массы. Прионы угрожают не всем белкам, а только изначально похожим на них самих. К сожалению, у млекопитающих такие белки присутствуют в клетках разных тканей. А поскольку прионы невероятно устойчивы к стандартным способам защиты организма, проникновение такого белка всегда приводит к заражению и всегда — к летальному. Несмотря на всю простоту прионов, люди пока не смогли придумать способов борьбы с ними за те полвека, что прошли с момента их открытия.

С одной стороны, живые организмы осуществляют много разнообразных действий, необходимых для самоподдержания и размножения. Каждое из них теоретически можно заблокировать, что поэтому считается потенциальной мишенью для лекарств. С другой — даже одноклеточные в процессе эволюции разработали различные способы защиты от вредных веществ, направленных на их уничтожение. А защищаться им есть от чего, и не только от человека и прочих «хозяев»: даже разные виды патогенов стремятся избавиться друг от друга, конкурируя за ресурсы.

Высшие организмы, начиная с позвоночных, имеют универсальную систему борьбы со всем чужеродным, что попадает в организм, — иммунную [4]. Эта система после обнаружения «чужака» запускает для его уничтожения производство специальных клеток — лимфоцитов. В дополнение начинается выработка антител — специальных белков, специфически связывающихся с мишенью, чтобы привлечь к ней еще больше лимфоцитов (рис. 1) [5]. А в случае, когда антител производится много, они оказывают и прямое действие на инфекционный агент.



Рисунок 1. Антитела — защитные белки (белого цвета) — специфически связываются с патогенами, в том числе с вирусными частицами.

На таком действии этих защитных белков основано применение профилактических вакцин [6] — медицинских препаратов, содержащих агенты, подобные настоящим инфекционным, что позволяет заранее выработать на них иммунный ответ. В этом кроется и главный недостаток вакцин: они лишь подготавливают организм к будущей инфекции, но бесполезны при уже начавшейся.

Кроме того, эффективность вакцин очень зависит от двух главных факторов: штамма (подвида) инфекционного агента и способности иммунной системы воспользоваться предоставленным ей шансом. В первом случае при встрече с новым, отличным от вакцинного вариантом патогена, наработанные антитела могут просто его не опознать, во втором — их может просто не хватить для его обезвреживания. Из плюсов вакцин можно выделить высокую стандартизацию процесса изготовления новых препаратов, не зависящего от типа возбудителя. Сразу после выяснения структуры «врага» можно приступать к производству вакцины.

Кроме помощи иммунной системе в выработке антител научились использовать в качестве лекарства и сами антитела. Однако так называемые терапевтические моноклональные антитела [7] действуют по другому механизму. Вместо прямого обезвреживания патогена или привлечения лимфоцитов к себе, моноклональные антитела обычно, грубо говоря, активируют иммунную систему по отношению к патогену, если есть какие-то проблемы с самостоятельной активацией, или более точно направляют ее, увеличивая эффективность борьбы. Конкретный механизм зависит от патогена и причин, из-за которых с ним не может справиться организм самостоятельно.

Совсем другое дело — препараты прямого действия, которые непосредственно воздействуют на патоген, не взаимодействуя с иммунной системой.

В случае одноклеточных микроорганизмов важным и, по сути, единственным классом таких веществ являются антибиотики — разнообразные и относительно небольшие молекулы с антимикробным действием [8]. При этом почти все современные антибиотики изначально являются веществами, которые сами микроорганизмы (в основном, бактерии) вырабатывают для борьбы со своими конкурентами. А удачные примеры созданных человеком химических соединений, за редким исключением, являются видоизмененными природными соединениями (например, фторхинолон, рис. 2).



Рисунок 2. Ципрофлоксацин — фторхинолон второго поколения. Система из двух ароматических колец с кетоном называется хинолоном. Ципрофлоксацин — один из наиболее эффективных антибиотиков, но вследствие высокой ядовитости и появления устойчивых штаммов бактерий от него начали постепенно отказываться.

И дело здесь не в нежелании изобретать велосипед, а в тех самых защитных механизмах микробов, которые и сейчас трудно обойти — и которые к тому же еще эволюционируют буквально на глазах. Поэтому почти все попытки создать антибиотик, специфичный для определенного штамма или вида, превращались либо в бесконечную погоню за эволюцией, либо почти сразу признавались экономически невыгодными.

Неудивительно, что создатели новых антибиотиков сейчас концентрируют свои усилия на поиске и разработке принципиально новых соединений широкого и длительного действия. Другими словами, лекарств сразу от большого числа инфекций, на которые микроорганизмы не смогут выработать защиту хотя бы в ближайшем будущем. Одним из таких соединений является тейксобактин [9] — антибиотик, полученный в 2015 году, к которому не обнаруживается устойчивость у грамположительных бактерий. В данный момент клинические испытания этого вещества идут полным ходом [10]. Поиск новых антибиотиков является очень важной темой в науке, мы же сегодня сосредоточимся на описании препаратов прямого действия против других, неклеточных инфекционных агентов — вирусов.

Вирусы — «полуживые» вредители

Вирусы, если говорить кратко, состоят из двух основных частей: генетического материала (ДНК или РНК) и оболочки — капсида, в который этот материал заключен и на котором находятся «инструменты» для связывания с клеточной мишенью (рис. 3). Поэтому и весь жизненный цикл вирусов включает всего несколько процессов: проникновение в клетку, копирование своего генетического материала, сборку новых вирусных частиц и выход из клетки.



Рисунок 3. Общее строение вирусной частицы. В зависимости от вида, у вирусов могут быть отличия. Например, не у всех видов есть суперкапсид. С другой стороны, у некоторых видов кроме нуклеиновых кислот внутри капсида могут быть свои, заранее заготовленные белки.

С вирусами может бороться иммунная система организма, особенно подготовленная вакциной. К тому же вирусы, в отличие от клеточных патогенов, не имеют защитных систем как таковых: в клетке хозяина, без оболочки, вирусный генетический материал и всё, что с помощью него производится, открыто для воздействий. Но у вирусов есть свое «ноу-хау»: для защиты они успешно используют две стратегические схемы.

Первая основана на принципе «лучшая защита — нападение»: при попадании в организм вирусы начинают размножаться с такой скоростью, что иммунитет за ними просто не успевает. Вторая — «маскировка», когда вирус внедряет свой генетический материал в геном клетки, после чего та уже не может распознать чужеродный кусок генетического кода. В таком виде вирус «ожидает» удобного момента для начала атаки. Таким образом, по этим причинам и из-за присущих вакцинам проблем, описанных выше, решительно приветствуется создание лекарств прямого действия против вирусов — своего рода «вирусных антибиотиков». Вопрос в том — где их взять?

Предполагается, что вирусы или подобные им молекулярные структуры возникли примерно в то же время, когда жизнь на Земле осваивала клеточный уровень, т. е. около 4 млрд лет назад. В какой-то момент группа молекул, возможно, уже имеющих индивидуальную оболочку, «поняла», что для успешного размножения необязательно иметь все необходимые средства у себя — можно воспользоваться чужими. Естественно, клеточные формы, культурно размножавшиеся своими силами, начали вырабатывать способы противодействия. И эта война разных форм жизни с разными типами паразитов, длящаяся уже несколько миллиардов лет, вряд ли когда-либо закончится.

Бактерии, одни из первых полноценных клеточных организмов, смогли выработать два довольно сложных механизма борьбы со своими вирусами (бактериофагами [11]): системы рестрикции-модификации и CRISPR-Cas [12]. С их помощью бактерии отличают попавшие к ним вирусные ДНК и РНК от собственных и буквально рвут своих врагов на части. При этом они не используют никакие специальные малые молекулы наподобие антибиотиков, как в случае борьбы с клеточными «собратьями».

Бактериальный «иммунитет» СRISPR-Cas имеет одну общую черту с нашим — усиление ответа при повторном заражении. Такая возможность появляется у бактерий за счет встройки в бактериальный геном коротких генетических фрагментов вирусов, которые могут использоваться как шаблон для «опознавания» чужеродной ДНК или РНК.

Гениальная догадка о возможности применять в качестве шаблонов не куски вирусных нуклеиновых кислот, а другие полезные последовательности ДНК привела к созданию очень эффективной системы для редактирования геномов живых организмов. Возможно, что в будущем люди научатся встраивать в свой геном систему CRISPR-Cas, чтобы использовать ее по первоначальному назначению — для борьбы с вирусами, пусть пока эта идея и кажется фантастической.

Нужно добавить, что и у высших организмов (не только у животных, но и у растений и грибов) имеется нечто подобное. Помимо иммунной системы, которая опознает не сам генетический материал возбудителя инфекции, а получающиеся на его основе продукты, существует еще и механизм РНК-интерференции [13]. Но этот механизм неспецифичен и предназначен для удаления любой лишней РНК, которая не нужна клетке на данный момент, поэтому противовирусная эффективность у нее низкая.

Таким образом, в случае вирусов мы не можем напрямую воспользоваться «наработками» бактерий как основой для создания противовирусных лекарств, как это было с антибиотиками. Нужно придумать что-то совершенно новое.

Мишень — вирус

Для начала более подробно рассмотрим жизненный цикл вирусов, на разные этапы которого, хотя бы теоретически, можно повлиять, а в идеале — и полностью заблокировать (рис. 4).



Рисунок 4. Жизненный цикл коронавируса и его потенциальные стадии-мишени. Это РНК-вирус: в качестве «наследственной» молекулы у него выступает не ДНК, а РНК, которая способна непосредственно служить матрицей для синтеза белков. Попав в клетку, вирус с помощью клеточных рибосом синтезирует фермент РНК-полимеразу, необходимую для копирования своей РНК. На следующем этапе в клетке синтезируется множество копий вирусной РНК, а рибосомы по матрице этой РНК собирают разнообразные вирусные белки. Далее с использованием других клеточных органелл происходит сборка вирусных нуклеокапсидов, а затем и самих частиц вируса. Они выходят наружу, когда зараженная клетка заканчивает жизнь апоптозом («самоубийством»).

Чтобы размножиться, вирусу необходимо попасть внутрь клетки. Проникновение можно разделить на три шага. Первый — связывание с определенными поверхностными белками клеток тканей и органов, где будет идти заражение. Вторым следует собственно проникновение — проход сквозь клеточную мембрану в цитоплазму, где и проходит третий этап — «раздевание» (лишение вируса оболочки). Затем начинается репликация вируса — копирование его генетического материала. В зависимости от исходного вида возбудителя, этот процесс может различаться, но мы не будем вдаваться в детали. В любом случае, размножение каждого вируса обязательно проходит через стадию создания РНК, так как именно она служит матрицей, по которой в клетке собираются вирусные белки.

У разных вирусов могут быть разные наборы белков. Какие-то вирусы являются «минималистами» и стараются по максимуму воспользоваться ресурсами клетки, другие шифруют всё, что им нужно, в своих ДНК или РНК. При этом геном большинства вирусов всё-таки содержит гены, кодирующие репликационные белки — ДНК- и/или РНК-полимеразы, поэтому они меньше зависят от клеточных ресурсов (рис. 5).



Рисунок 5. Полимеразы у всех живых существ устроены примерно одинаково. Их субстратом служат молекулы ДНК или РНК, а также отдельные мономеры-нуклеотиды, из которых ДНК- и РНК-полимеразы собирают копии нуклеиновых кислот. На рисунке изображена структура полимеразы, катализирующей транскрипцию ДНК в матричную РНК — молекулу, служащую матрицей для сборки белков.

Для сборки новых вирусных частиц (вирионов) нужно иметь две составляющие: нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК) и структурные белки капсида. Также требуются сборочные белки — чаще всего это белки хозяина, но иногда вирусы обходятся своими силами. Помимо структурных белков, в вирусных геномах закодированы неструктурные, обслуживающие процессы размножения вируса (ингибиторы синтеза клеточных РНК и белков, протеазы и др.), поверхностные белки и т.п.

Завершением цикла размножения является выход вирионов из клетки. Для этого есть разные способы. Некоторые вирионы аккуратно выходят через мембрану, а вот другие принуждают свою хозяйку закончить жизнь самоубийством (апоптозом) и разрушиться.

Сразу отметим, что стадии «раздевания» вирионов и выхода их из клетки требуют взаимодействия большого количества уникальных белков — как хозяйских, так и вирусных, — поэтому считаются сложными мишенями для специфического воздействия и находятся внизу списка приоритетов ученых-разработчиков лекарств. Зато стадия репликации, напротив, самая привлекательная. Всё дело в том, что вирусные ферменты, играющие здесь главные роли — ДНК- и РНК-полимеразы, — очень консервативны. Другими словами, структурно и функционально они очень похожи на все другие ферменты, выполняющие ту же задачу.

Вообще, подобное молекулярное сходство с известными примерами — это первое, что пытаются выявить и учесть при начале разработки нового лекарства. Если оно есть, открывается возможность использовать уже накопленные знания по ферментам данного типа, включая структуру его самого и молекул субстратов, с которыми он взаимодействует; условия, в которых протекают химические реакции, и т.д. Если повезет, то окажутся известны и вещества, блокирующие какой-либо из аналогичных ферментов.

И полимеразы — именно такие ферменты, что неудивительно: их субстраты (ДНК, РНК и отдельные их «звенья»-нуклеотиды) есть у всех живых организмов и устроены по одному плану. Поэтому в случае с вирусной полимеразой сразу приходит в голову мысль взять за основу лекарства один из субстратов (лучше какой-нибудь нуклеотид, потому что он меньше и проще) и так изменить его, чтобы он «стопорил» ее работу.

Зная структуру полимеразы — а главное, ее активного центра, где проходит реакция — и особенности субстрата, можно быстро понять, какие вещества могут стать потенциальными блокаторами — ингибиторами. Но здесь возникает проблема специфичности. Из-за того, что активные центры разных полимераз почти одинаковы, ингибитор не должен сильно отличаться от природного субстрата, иначе он просто не впишется в активный центр. С другой стороны, он должен связываться не со всеми имеющимися в клетке полимеразами, а выбирать именно вирусную. И это огромная проблема.

На данный момент уже зарегистрировано множество так называемых нуклеотидных ингибиторов полимераз, эффективность связывания которых с целевой вирусной полимеразой очень мала. Из-за неспецифичного связывания с другими (в первую очередь, клеточными) ферментами, они имеют внушительный список побочных эффектов. Тем не менее, даже такие лекарства идут в ход в критических случаях, когда польза от их применения может превысить ожидаемый вред.

Однако и в этой области есть прорывы. Для полимераз некоторых вирусов удалось найти очень специфичные ненуклеотидные ингибиторы. Примеры — эфавиренз и невирапин, лекарства против СПИДа [14]. Их активные молекулы связываются с вирусной полимеразой уже не в активном центре молекулы, а в ее «кармане», блокируя работу фермента (такие молекулы называют аллостерическими регуляторами [15]). Лечение такими лекарствами достаточно эффективно — до тех пор, пока вирус не обретет к ним устойчивость. А он обязательно ее обретет, потому что такой «карман» неважен для основной деятельности полимеразы и в ходе размножения может измениться в результате мутаций.

Ингибиторы стадий связывания и интеграции на примере ВИЧ

Высокоспецифичные ингибиторы теоретически можно создать и для молекул, работающих на стадиях связывания вириона с клеточной оболочкой и сборки новых частиц. Для последней стадии сделать это пока не получилось. А вот связывание вируса ВИЧ с клеткой удалось изучить настолько, чтобы создать очень специфичные ингибиторы.

У ВИЧ есть по крайней мере два оболочечных белка, которые он использует для связывания с клеткой и последующего внедрения. Ингибиторы для этих белков уже есть — энфувиртид и фостемсавир. К сожалению, и к ним вирус может выработать устойчивость, но в данном случае это произойдет позже, так как белки связывания обладают некоторой консервативностью. Следовательно, и лечение этими двумя лекарствами обычно более эффективно.

Только у ретровирусов, к которым относится и возбудитель СПИДа, есть особый фермент (интеграза), встраивающий генетический материал вируса в геном хозяина. И для интегразы ВИЧ уже разработано несколько ингибиторов, среди которых выделяются ралтегравир и долутегравир.

Помимо описанных мишеней, есть немало и других белков, важных для размножения вируса. Например, это белки, «обслуживающие» стадию репликации и следующую за ней стадию трансляции — синтеза белка на основе информации, закодированной в РНК.

Кроме того, с переменным успехом удается создавать ингибиторы отдельных ферментов разных вирусов. К примеру, вещество балоксавир ингибирует составную часть комплекса фермента РНК-полимеразы гриппа, который подготавливает начало репликации вируса [16]. Балоксавира марбоксил — это пока единственное из всех специфических противогриппозных средств, доказавшее свою эффективность и безопасность во всех проведенных испытаниях.

На прицеле — протеазы

Особый интерес разработчика противовирусных препаратов вызывают протеазы — ферменты, расщепляющие белки (рис. 6). Например, вирусные протеазы, которые разрезают большие синтезированные «полипротеины» на отдельные функциональные белковые молекулы. Несмотря на нормальную структуру даже в связанном состоянии, их разделение совершенно необходимо для осуществления своих функций. Если такой фермент блокировать, размножение вируса можно остановить. К сожалению, не все вирусы нуждаются в таких протеазах, но, если они имеются, на это сразу обращают внимание.



Рисунок 6. Полипептид, синтезированный на клеточной рибосоме по вирусной мРНК, разрезается на отдельные белки вирусными протеазами. Несмотря на необходимость наличия специальных ферментов для нарезания полипротеинов, такой способ получения функциональных белков, и вообще такая организация генома вируса несут несколько полезных особенностей, например, бóльшую компактность генома и дополнительные возможности регуляции вирусного цикла.

Все протеазы обладают примечательным сочетанием свойств, описанных выше. Во-первых, все они осуществляют одну и ту же химическую реакцию в силу того, что белки, как и нуклеиновые кислоты, по структуре у всех живых организмов похожи. И если у вируса, пусть даже нового и неизученного, обнаруживается протеаза, то сразу можно уверенно говорить о ее функции и, частично, о строении. Во-вторых, протеазы обладают намного бóльшей специфичностью к своим субстратам, чем те же полимеразы, потому что разрезают только нужные им белки и только в нужных местах. И это вполне закономерно.

Всё дело в том, что полимеразы выполняют универсальную и очень консервативную функцию — точный синтез одной нуклеиновой кислоты на основе другой. ДНК и РНК всегда имеют пусть и разную последовательность, но одинаковую структуру. Полимеразы не различают основные нуклеотиды, используемые для синтеза, зато легко отличают даже немного измененные, образующиеся, к примеру, при повреждении основных.

Протеазы же выполняют неуниверсальную функцию — у них стоит задача распознать и разрезать только заранее определенную последовательность аминокислотных остатков белка. Отсюда следует как высокая специфичность, так и частичная потеря в структурной консервативности у этих ферментов.

Разные протеазы проводят одну и ту же реакцию с очень разными последовательностями аминокислотных остатков. Поэтому их активный сайт состоит из двух частей: каталитический центр, где проходит реакция расщепления; и связывающий центр (набор «карманов», в которые попадают боковые цепи только целевого белка). Можно догадаться, что каталитические центры у всех протеаз будут очень похожими, в то время как связывающие — очень разными. При этом каталитический центр всегда намного меньше размером, так как в химической реакции участвует очень маленькая, всего лишь с несколькими атомными связями, часть белковой молекулы.

Кроме того, те же нуклеиновые кислоты могут позволить себе быть очень большими, а вот белкам «лишний вес» совсем не нужен. Ведь чем меньше белок, тем меньше ресурсов затрачивается на его создание и тем больше белковых единиц может поместиться в заданном объеме. А это важно, когда для функционирования желательно присутствие многих рабочих «копий».

В целом, все эти хорошо изученные черты протеаз открывают возможности для создания для них высокоспецифичных ингибиторов, причем относительно быстро. Как идет такой процесс — рассмотрим на примере коронавирусов, представители которых стали в XXI в. причиной не только нескольких эпидемий, но и пандемии, унесшей жизни миллионов человек.

Коронавирус и его главная протеаза

Коронавирусы — это семейство РНК-содержащих вирусов, вызывающих инфекции дыхательных путей у млекопитающих и птиц [17]. Первые случаи коронавирусных инфекций были зарегистрированы у домашних кур около ста лет назад, а у людей — во второй половине прошлого века. Коронавирусы впервые привлекли к себе пристальное внимание во время эпидемии тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС, или SARS), или атипичной пневмонии, возбудителем которого является SARS-CoV.

В результате изучения структуры этого вируса выяснилось, что у него есть две протеазы, одна из которых обязательна для размножения. Когда была получена трехмерная структура этой протеазы, названной главной (в сокращенной форме на англ. — Mpro), оказалось, что она во многом подобна другой, известной и хорошо изученной протеазе — трипсину из секрета поджелудочной железы животных и человека (рис. 7А, рис. 7Б). Кроме того, была определена специфичность Mpro, т.е. последовательность аминокислотных остатков, которую распознает и разрезает эта протеаза.



Рисунок 7А. Модель молекулы бычьего фермента трипсина, синтезирующегося в поджелудочной железе.

Неудивительно, что ингибиторы других протеаз, подобных Mpro, были сразу опробованы в качестве средства против коронавируса [18]. И они оказались эффективны! Конечно, эта эффективность была низкой, но направление было задано. Следующим шагом стал поиск более специфичных ингибиторов на основе полученных знаний.

Одновременно, чтобы начать лечение тяжелобольных, были сделаны попытки найти «рабочие» лекарства среди уже официально зарегистрированных. «Перенацеливание» лекарств — быстрый и выгодный способ терапии нового заболевания [19], [20], ведь характеристики таких препаратов хорошо изучены, включая дозировку, действие на организм и побочные эффекты. И, чтобы перенацелить «старое» лекарство на новую болезнь, нужно лишь проверить, будет ли оно полезно при максимальной дозе.

В испытаниях с коронавирусом результаты, к сожалению, оказались отрицательными, и не только в случае протеазы. Позже, уже после первой эпидемии коронавирусной инфекции, был опробован боцепревир — ингибитор протеазы гепатита С [21]. Он также не показал достаточной эффективности, но, забегая вперед, оказался очень хорошей основой для создания сильных ингибиторов Mpro.

Поиск новых лекарств — машинный и «ручной»

Если не получается найти лекарство среди известных, значит, нужно создавать новое. И пусть новые терапевтические молекулы будут мало отличаться от уже изученных, из принципа безопасности их придется проверять заново [22]. Да и синтезировать их обычно также нужно с нуля. Всё вместе получается очень дорого и долго.

Естественно, это не останавливает исследователей и заказчиков, но заставляет задуматься о способах экономии ресурсов. Со стороны исследователей главным способом является поиск среди всех уже имеющихся соединений. Трудность в том, что список этот исчисляется миллионами и должен быть сокращен.

При поиске нового потенциального ингибитора среди «готовых решений» сначала ставят теоретические ограничения, чтобы отсеять молекулы, которые заведомо не могут оказаться хоть сколько-нибудь действенными. Затем, составив умозрительно несколько «типажей» предположительно хороших вариантов, оценивают то, что есть в наличии. Практические причины, ограничивающие разнообразие вариантов, просты: некоторые соединения могут быть ядовитыми, некоторые — иметься в недостаточных количествах даже для первичного исследования, другие находятся за тысячи километров от лаборатории, где создают новое лекарство.

Больших раздумий требует именно первый, теоретический этап [23], [24]. В качестве критериев отбора за основу берут всё те же знания о субстрате фермента (если он есть) и уже известных молекулах, которые хоть как-то влияют на его активность. И начинают буквально измерять линейкой: оценивают общий размер и форму субстрата и ингибиторов, их отдельные части и химические группы, взаимное расположение последних… Важны и такие свойства, как электрический заряд, жесткость молекулы и т.п. Суммарно все это называется QSAR (quantitative structure-activity relationship) — метод поиска количественных соотношений «структура—свойство». Этот метод используется и при создании новых соединений путем модификации уже известных.

От физических свойств — к физиологическим

Имея обширную статистику по химическим и биологическим свойствам реальных соединений и пользуясь методом QSAR, можно составить относительно простые и понятные эмпирические критерии, удовлетворяя которым, новое химическое соединение с большой вероятностью будет иметь хорошие второстепенные лекарственные качества, такие как всасываемость, распределение, метаболизм и выделение (чаще упоминается английская аббревиатура ADME — absorption, distribution, metabolism, excretion [25]). Одним из таких наборов критериев являются правила Липински, задающие определенное количество гетероатомов (атомов азота и кислорода) в молекуле, молекулярную массу и отношение липофильности к гидрофильности.

Так как эти правила основаны на практике, а не на теории, у них есть множество исключений в обе стороны. То есть, с одной стороны, если соединение не удовлетворяет данным критериям, оно всё равно может в реальности обладать хорошими свойствами. И наоборот, удовлетворение всем критериям не гарантирует приемлемых реальных свойств. Тем не менее, подобные правила задают некоторый уровень, к которому иногда полезно стремиться, особенно в случаях, когда уже есть какое-либо действующее вещество и нужно улучшить именно его ADME-качества.

Задав список важных свойств потенциального ингибитора, его загружают в специальную компьютерную программу, которая проверит на предмет соответствия все соединения из различных баз данных. На выходе получают список тех из них, которые наиболее соответствуют критериям в порядке убывания.

И здесь исследователей поджидают проблемы. Во-первых, выданный список может быть пуст из-за того, что было задано слишком много ограничений и ни одно известное соединение даже близко ему не удовлетворяет. В таком случае набор этих параметров начинают сокращать, что приводит к новой проблеме: в подавляющем большинстве случаев отобранные молекулы оказываются очень маленькими. Почему это происходит?

Дело в том, что при урезании списка важных свойств в первую очередь страдает сложность молекулы и ее размер — труднее всего найти именно «полноразмерную» молекулу нужной формы. Использование даже очень похожих по форме соединений почти всегда ведет к плохому результату из-за несовместимости: активные центры ферментов обычно достаточно «жесткие» и плохо подстраиваются под форму связывающихся молекул, что необходимо для достижения нужной специфичности. И когда молекул с подходящим аналогом какой-либо части среди соединений той же формы не находится, отбираются те, у которых эта часть просто отсутствует.

Полученные таким образом молекулы оказываются намного меньше заданных. Связываются с целевым белком они обычно всё еще хорошо, но вот высокой избирательностью к нужному ферменту уже не отличаются. Как известно, различные молекулярные «карманы» имеются почти у всех ферментов, и подобные маленькие молекулы в них охотно заходят. «Застревая» там надолго, они в лучшем случае не приносят пользы, в худшем — блокируют работу других, нецелевых ферментов. Поэтому успешные находки здесь — редкость.

Рациональный дизайн: играем в молекулярный конструктор

Когда не удается найти хорошие варианты молекул среди имеющихся, наступает время «ручного» вмешательства вкупе с творческим подходом. И тут нужна смекалка, ведь молекула искомого ингибитора фермента должна удовлетворять жестким ограничениям [23], [24].

Во-первых, она должна напоминать природный субстрат, чтобы хорошо связываться с активным местом фермента, иначе оно не сможет вместить его и подстроиться. При этом молекула ингибитора не должна быть полной копией природного субстрата, иначе не окажет блокирующего влияния. Во-вторых, она не должна быть слишком маленькой, чтобы сохранить специфичность (хотя есть редкие положительные примеры). Но не стоит рассматривать варианты и очень больших молекул, так как при увеличении размера может резко вырасти сложность химического синтеза. Наконец, стоит избегать присутствия в молекуле ингибитора химических связей, склонных разрушаться спонтанно, а также отдельных частей с общей токсичностью, что, в свою очередь, может быть предсказано на основе опыта доклинических испытаний уже известных веществ, похожих на новое.

При разработке ингибиторов с нуля ради экономии реальных ресурсов полезно начинать работу с компьютерного анализа. Есть два главных компьютерных метода предсказания эффективности потенциальных ингибиторов. Первый — молекулярный докинг [26], довольно грубый метод, который обычно применяют для получения черновых результатов. В этом методе специальная программа получает «на вход» структуру фермента с указанием координат активного центра, где будет связываться ингибитор, и набор различных молекулярных структур для оценки, среди которых могут быть как известные, так и новые. В методе докинга белок «фиксируется» в пространстве, а ингибитор поворачивается вокруг него и изгибается, пытаясь «пристроиться» наилучшим способом. На выходе исследователь получает список структур с лучшим связыванием (рис. 8).



Рисунок 8. В случае использования молекулярного докинга белок-мишень неподвижен, а потенциальный ингибитор «подстраивается» под него. На выходе получают различные положения этой молекулы внутри активного центра фермента, с соответствующими коэффициентами «хорошести». По этому параметру выбирается один или несколько лучших вариантов (выделен зеленым цветом), который потом может быть более детально описан с применением метода молекулярной динамики.

Докинг не требует больших вычислительных ресурсов, поэтому с его помощью можно относительно быстро, за несколько дней, просканировать тысячи соединений, используя обычные компьютеры. Этот метод в основном используется либо для отсева совсем плохих вариантов, либо для поиска молекул с необычной и на первый взгляд неподходящей структурой.

Когда стоит задача создать действительно хороший ингибитор или значительно изменить структуру уже имеющегося, используют метод молекулярной динамики (МД) [27]. Он может быть применен сразу, минуя этап докинга, в случае модификации малоэффективных ингибиторов, для которых уже известно, как будет располагаться в белковом «кармане» измененная молекула.

Преимущество метода МД в том, что он исследует поведение комплекса белок—ингибитор во времени, а не одномоментно, как в докинге (рис. 9). С помощью такого компьютерного моделирования можно более точно предсказать различные взаимодействия, возникающие между ингибитором и активным центром фермента, в то время как в докинге основное внимание уделяется соответствию форм молекулы и карманов связывающего центра.



Рисунок 9. Несколько состояний комплекса потенциального ингибитора с протеазой, полученных методом молекулярной динамики. Связанная с протеазой молекула занимает примерно одинаковые положения во всех «кадрах», что означает, что комплекс стабилен и промоделированная молекула является потенциальным ингибитором. Голубыми линиями показаны водородные связи между белком и ингибитором.

Здесь же начинается, по сути, игра в конструктор, вот только моделью выступает не какая-нибудь машинка, а потенциальное лекарство. Опробовав в МД различные известные молекулы, оказывающие влияние на фермент, и соотнеся результаты моделирования с результатами реальных опытов, можно выявить закономерности их взаимодействия и понять, что нужно изменить.

Например, можно увидеть, что какая-либо часть молекулы известного ингибитора не находится в контакте с поверхностью белка, что является признаком «малополезности». Ведь ингибитор должен как можно теснее контактировать с белком, чтобы между ними действовала максимальная сила притяжения, а также максимальная «прижимная сила» со стороны воды как растворителя. В другом случае можно увидеть, что ингибитор заметно меняет форму активного центра фермента. Это означает, что ему нужна дополнительная энергия, чтобы противостоять жесткости «кармана» и изменить его форму. В реальности свободные молекулы такого ингибитора зачастую просто будут не в состоянии связаться с ферментом.

Есть еще множество признаков, по которым оценивается потенциальная «сила» ингибитора при моделировании методом МД. После оценки известных молекул можно приступать к их улучшению. К примеру, можно так изменить ингибитор, что он «приклеится» к ферменту. Каждое такое изменение подразумевает отдельное моделирование, которое занимает уже больше времени — сутки-двое для одной молекулы. Но подобные затраты окупаются, да и само это занятие скучным не назовешь.

Проблемы молекулярной динамики и их возможные решения

Ферментативные процессы в реальности идут очень быстро. Например, то же связывание молекулы ингибитора с ферментом может происходить в течение нескольких миллисекунд после попадания вещества в клетку. Но при попытке промоделировать подобные процессы целиком возникают две проблемы. Первая — высокая ресурсоемкость. Всего около трех лет назад стали появляться первые работы с масштабными моделированиями методом МД длиной более 1 миллисекунды. В большинстве же современных работ довольствуются микросекундами (хотя прогресс стремителен — двадцать лет назад радовались и нескольким наносекундам).

Другая проблема — точность вычислений. Фактически, классическая МД (основанная на методе молекулярной механики) не рассчитана на столь большую длительность времени и на моделирование каких-либо сложных изменений в структуре молекул. Во-первых, при длительном моделировании накапливаются ошибки вычислений, которые могут привести к совершенно нереалистичному результату в конце. Во-вторых, некоторые структурные изменения могут вообще не происходить сколь угодно долгое время моделирования, хотя в реальности происходят спонтанно за милли- и даже микросекунды.

За долгие годы существования метода МД было придумано несколько важных и полезных улучшений, позволяющих отчасти решить описанные проблемы. Но главным достижением в методах молекулярной динамики вполне можно назвать внедрение методов квантовой теории, значительно уточняющих вычисления. Получившийся метод КМ/ММ (квантовой механики/молекулярной механики) уже давно используется для точного моделирования, например, отдельных состояний каталитических стадий фермент-субстратных взаимодействий. А вот полноценную динамику на основе КМ/ММ начали делать совсем недавно, когда стали позволять вычислительные ресурсы, коих для этого метода нужно на порядки больше. Типичной же длительностью моделирования стали всё те же наносекунды. Поэтому некоторые ученые-биологи ждут выхода новых компьютерных видеокарт, задействованных в теоретических расчетах, не меньше, чем видеомонтажеры или компьютерные игроки.

Ингибиторы коронавирусной Mpro

В случае коронавирусной протеазы Mpro работы по рациональному дизайну начались с изучения ингибиторов протеаз других вирусов [28]. Быстро выяснилось, что заметное влияние на нее оказывает рупинтривир, первоначально разработанный для лечения ОРВИ, вызванной риновирусами [29]. Это действие препарата было предсказано на основе сравнения специфичности риновирусной и коронавирусной протеаз, которые оказались близки. Рупинтривир — это так называемый «пептидоподобный» ингибитор, по своей структуре напоминающий цепочку аминокислот. Чтобы такая цепь остатков не расщеплялась ни самой протеазой, ни другими ферментами, необходимо было изменить ту часть молекулы, которая подвержена расщеплению.

Ранее уже упоминалось, что малый размер каталитического центра протеазы — это плюс при разработке ингибиторов: ведь часть молекулы субстрата, в которой разрывается связь при расщеплении, также будет мала. И защитить ингибитор от расщепления можно, изменив лишь небольшой его фрагмент, причем такое малое изменение вряд ли повлияет на силу его связывания с ферментом.

Для рупинтривира и многих других ингибиторов разных протеаз было разработано несколько способов защиты от расщепления самой протеазой. При этом удалось не только не нарушить, но иногда даже улучшить связывание, заставляя ингибитор создавать с ферментом сильную ковалентную химическую связь.

Еще одна защита требуется «концам» молекулы ингибитора, которые не должны напоминать стандартные аминокислотные остатки, чтобы избежать опасности расщепления другими ферментами. А так как обычно такие защитные группы имеют значительный размер и могут сами сильно взаимодействовать с ферментом, очень желательно объединить защитные свойства со связывающими. Для рупинтривира и протеазы риновируса этого добиться удалось, но позже выяснилось, что именно из-за этой защитной группы ингибитор плохо связывается с протеазами других вирусов.

Ингибитор как лекарство

В случае коронавируса — возбудителя ТОРС — подходящие варианты ингибитора для протеазы Mpro нашлись сравнительно быстро. Исследователи из транснациональной компании Pfizer уже в 2004 г. предложили ингибитор PF-231 (рис. 10) [30], прекрасно блокирующий Mpro не только SARS-CoV, но и всех последующих коронавирусов, и с этой стороны он до сих пор не превзойден. Но при попытке сделать из него лекарство возникло несколько серьезных проблем.



Рисунок 10. Ингибитор PF-231 внутри активного центра коронавирусной протеазы (Mpro). Штриховыми линиями показаны водородные связи, возникающие между ингибитором и ферментом. PF-231, созданный компанией Pfizer уже в 2004 г., способен блокировать главную протеазу не только SARS-CoV — возбудителя атипичной пневмонии, — но и всех последующих коронавирусов, включая SARS-CoV-2.

Дело в том, что уже при отборе наиболее перспективных вариантов ингибитора (или улучшении уже имеющегося) о нем нужно думать как о лекарстве, которое будет работать не только в пробирке, но и в организме. Ведь чтобы дойти до своей мишени, ему придется преодолеть много различных препятствий. В этом смысле важны такие свойства, как, к примеру, растворимость и способность проникать через клеточную мембрану. И в идеале это нужно учитывать сразу, потому что можно зайти в тупик, создав такие молекулы, которые даже теоретически не будут работать в организме, как их ни оптимизируй.

Исследователи из Pfizer, конечно же, пытались сразу учесть все эти факторы, но с первого раза создать совершенную молекулу им не удалось. Две проблемы, которые PF-231 в своем первоначальном виде не смог преодолеть, состоят в невозможности принимать препарат через рот и получить желаемую максимальную терапевтическую дозу [30], [31]. Конечно, возможность перорального приема необязательна: лекарство всегда можно вводить путем инъекций. Так оно и действует быстрее, и можно вводить более высокие дозы препарата. Но в периоды эпидемий, когда каждый день в больницы поступают сотни и тысячи новых пациентов, важность самостоятельного приема лекарства резко возрастает.

PF-231 очень плохо всасывается в желудочно-кишечном тракте — около 98–99% действующего вещества просто выводится из организма. Поэтому его попытались вводить внутривенно, но здесь столкнулись со следующей проблемой — плохой растворимостью: максимальным числом молекул, которые можно поместить в единицу объема растворителя без выпадения осадка. Растворимость ингибитора должна быть достаточной высокой, чтобы человек мог принять дозу, необходимую для полного ингибирования целевого фермента. Но если на сегодня целенаправленно улучшить всасываемость вещества трудно (все влияющие на это факторы пока неизвестны), то повысить растворимость легко.

PF-231 был модифицирован, и уже в таком виде протестирован в клинических испытаниях, где, тем не менее, проиграл другой, более современной разработке той же компании, известной как нирматрелвир (кодовое название PF-332; рис. 11А, 11Б), которая в итоге станет основой лекарства против коронавируса под названием «Паксловид» [31].



Рисунок 11А. Структура молекулы PF-332 или нирматрелвира.

К сожалению, несмотря на несколько эпидемий коронавирусных инфекций и наличия нескольких «заготовок» лекарств, включая PF-231, сделанных чуть ли не два десятилетия назад, к их клиническим испытаниям приступили только несколько лет назад. А закончились эти испытания совсем недавно — в конце 2021 г. [31], спустя два года после начала пандемии. В далеком 2004 г., когда первая коронавирусная эпидемия практически сошла на нет, начинать тестирование этих препаратов казалось нецелесообразным. Если бы мы могли предвидеть будущее…

Лекарство из Сибири

В новосибирском Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН решение присоединиться к поискам новых высокоэффективных ингибиторов главной протеазы коронавируса было принято весной 2021 года. Начало было положено совместной работой двух наших лабораторий — лаборатории генетических технологий и лаборатории исследования модификации биополимеров ИХБФМ СО РАН — и коллективом московских ученых, в числе которых были сотрудники Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН) и Федерального научного центра исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН.

Коллектив москвичей на тот момент уже вел работу с коронавирусной протеазой и вел поиск потенциальных ее ингибиторов среди химических соединений нового класса. В итоге московскими коллегами был получен набор молекул, для которых предсказывалось наличие ингибирующей активности. Далее должны были следовать первые испытания этих молекул и дальнейшее описание их свойств. Эти испытания делятся на два вида: опыты на биологических моделях, обычно клеточных культурах (in vivo), и опыты с отдельными веществами, то есть наблюдение за прямыми взаимодействиями фермента с ингибитором в пробирке (in vitro). Именно вторая часть исследований была поручена нам.

Наши лаборатории специализируются в области физической химии биополимеров, включающей молекулярно-кинетический анализ механизмов взаимодействия биомолекул, оценку эффективности взаимодействий и факторов, влияющих на этот процесс, а также разработку подходов, позволяющих изменять ферментативные свойства изучаемых биомолекул как за счет изменения их субстратной специфичности, так и изменения типа каталитической активности. В первую очередь, мы проводим исследования белок-белковых и белково-нуклеиновых взаимодействий, но не ограничиваемся этим. Большой опыт работы в этой области позволил нам быстро переориентироваться и разработать методику оценки фермент-ингибиторных взаимодействий. Проверки выданных нам новых соединений были быстро и успешно завершены, и на основе полученных результатов опубликована статья в научном журнале [32].

Однако, к сожалению, московские ингибиторы показали низкую ингибирующую способность in vitro. С другой стороны, оставались возможности, а главное — желание создать более эффективные ингибиторы. Анатолием Булыгиным, младшим научным сотрудником ИХБФМ СО РАН, специализирующимся на компьютерных методах анализа биомолекул, было проведено компьютерное моделирование взаимодействий Mpro с московскими молекулами с целью выяснить их «слабые места» и по возможности придумать способ улучшения этих молекул. Выяснилось, что данные молекулы требуют серьезной доработки для повышения своей эффективности, что фактически не отличало данный путь от разработки ингибиторов с нуля. Поэтому было принято решение разработать новые эффективные ингибиторы, пользуясь уже всеми знаниями и опытом, накопленными мировым научным сообществом к тому времени.

На момент начала наших работ наиболее перспективным всё еще считался PF-231, хотя уже было исследовано много других ингибиторов Mpro, созданных с 2004 г. Результаты всех этих исследований были тщательно изучены, на их основе было выдвинуто несколько оригинальных предположений о связях между структурой и эффективностью ингибиторов.

С помощью метода молекулярной динамики и моделирования десятков различных химических соединений удалось выяснить, что есть возможность улучшить растворимость и, возможно, всасываемость ингибитора на основе PF-231. Другим интересным вариантом было улучшение несколькими способами силы связывания с ферментом других соединений, которые первоначально обладают достаточной растворимостью.

Примерно в это же время была опубликована статья специалистов Pfizer [31] с промежуточными результатами клинических испытаний PF-231 и PF-332. Оказалось, что в компании частично использовали те же модификации ингибиторов, которые обсуждали и мы. Но существенные различия между нашими и их наработками всё же остались, поэтому в институте было принято решение перейти к этапу синтеза соединений для проверки в реальных опытах.

Синтез химических соединений — один из самых долгих этапов при разработке нового препарата. Ведь хотя ингибиторы и являются пептидоподобными веществами, их невозможно синтезировать так, как синтезирует белки живая клетка. Присоединение каждой химической группы к центральному звену выливается в одно-двухнедельную работу целой группы химиков-синтетиков, а создание целевой молекулы растягивается более чем на полгода. Но, как уже говорилось ранее, эти затраты и ожидание с лихвой окупаются за счет пользы от главной особенности препаратов прямого действия, отличающих их от вакцин, — возможности применения при уже начавшейся инфекции.

К середине 2022 г. совместными усилиями нескольких лабораторий ИХБФМ СО РАН и ИБХ РАН был проведен синтез более двух десятков новых перспективных соединений. Это соединения как модифицированные с основой от PF-231, так и собранные из частей других ингибиторов и из блоков, придуманных с нуля. Далее, уже в нашей лаборатории, были проверены их ингибирующие свойства в отношении главной протеазы коронавируса. Три из них продемонстрировали высокую ингибирующую способность по отношению к Mpro возбудителя COVID-19 — коронавируса SARS-CoV-2, что дало повод для составления заявки на патент. Все эти вещества проходят дальнейшую проверку и в перспективе могут стать основой для создания первого отечественного лекарства прямого действия против коронавирусной инфекции.

Заключение**

Понимание принципов «взаимоотношений» между вирусами, бактериями, грибами и высшими организмами, в первую очередь человеком, позволяет нам определить «болевые» этапы в процессах размножения этих микроорганизмов и распространения инфекционных заболеваний, вызванных конкретным возбудителем. При этом возможности человечества в непрекращающейся борьбе с инфекциями значительно возрастают не только благодаря разработке новых экспериментальных подходов, но и за счет всё более активного использования высокопроизводительных вычислений, машинного обучения и передовых компьютерных методов в целом. Сочетание этих двух «потоков» современных знаний и рост технической оснащенности позволяет раскрыть множество тайн «химии природы», включая молекулярные механизмы жизнедеятельности бесчисленных микроорганизмов, населяющих нашу планету. И это делает возможным создание прорывных разработок для борьбы с инфекционными заболеваниями.

Эта статья впервые была опубликована в журнале «Наука из первых рук» [33].