Лаборатория структуры и функции рибосом

Малыгин Алексей Аркадьевич

доктор химических наук, г.н.с.,
телефон: (383) 363-51-39
Email

• Изучение структурно-функциональной организации трансляционных комплексов рибосом человека на уровне пептидов рибосомных белков, участвующих в трансляции и контроле качества транслируемых мРНК.
• Исследование функциональной роли рибосомных белков, ассоциированных с рибосомопатиями и канцерогенезом, в экспрессии генов в клетках человека.
• Изучение структурно-функциональных аспектов молекулярных механизмов, обеспечивающих доставку РНК и белков в экзосомы.
• Выявление конформационных особенностей мРНК в различных типах комплексов 80S рибосом человека с помощью методов электронного парамагнитного резонанса.

1. Установлена функциональная роль специфических пептидов белков – компонентов мРНК-связывающего канала рибосомы человека в инициации и элонгации трансляции и в контроле качества мРНК, входящих в канал.

• Показано, что аминокислотные остатки в положениях 60-63 белка uS3, принадлежащие пептиду 55-64, экспонированному в 40S субчастице рибосомы вблизи входа в мРНК-связывающий канал, играют критическую роль в инициации трансляции, а эукариот-специфичный С-концевой пентадекапептид белка uS19, формирующий декодирующий центр, участвует в аккомодации аминоацил-тРНК в рибосомном А-участке, необходимой для последующей транспептидации (Babaylova et al., 2019; Bulygin et al., 2020).
• Обнаружено взаимодействие вышеупомянутого пептида 55-64 рибосомного белка uS3 с апуриновыми/апиридиновыми (AP) сайтами в мРНК в составе комплексов 80S рибосом человека с тРНК, направляемой в Р-участок, и синтетическими аналогами мРНК с 3'-концевым AP сайтом с образованием соответствующей сшивки (Ochkasova et al., 2019). Показана возможность такой сшивки во время трансляции в бесклеточной белоксинтезирующей системе с использованием набора синтетических мРНК, содержащих AP сайт в различных участках их кодирующих последовательностей, и сделан вывод об участии этого пептида в проверке качества мРНК на наличие AP сайта, обнаружение которого приводит к прекращению её трансляции (Ochkasova et al., 2021).

2. С использованием подходов, основанных на использовании клеточных технологий в сочетании с методами высокопроизводительного секвенирования РНК, получены новые данные об особенностях взаимодействия транслируемых мРНК с белком uS19, компонентом декодирующего центра рибосом млекопитающих, и белком YB-1, регулятором трансляции, ответственным за сортинг мРНК в экзосомы.

• Установлены регионы мРНК, с которыми взаимодействует белок uS19 в транслирующих рибосомах, и показано, что эти регионы представлены последовательностями с высокой встречаемостью кодонов лизина, глутамина и аргинина, на которых паузируют рибосомы в процессе элонгации трансляции вследствие замедления в прохождении соответствующего пептида по рибосомному туннелю (Babaylova et al., 2020a).
• Идентифицированы клеточные мРНК – партнеры белка YB-1, большая часть из которых представлена мРНК, классифицированными как упакованные мРНК и содержащими в 3’-нетранслируемых областях вырожденные консенсусные последовательности, ответственные за кооперативное связывание YB-1 с мРНК. Сделан вывод, что связывание YB-1 с этими последовательностями инициирует его последующую мультимеризацию, приводящую к компактизации мРНК и её предположительному переносу в экзосомы (Gopanenko et al., 2020a).
• Установлено, что дефицит рибосомных белков eL29 и eL38 в клетках запускает каскад событий, приводящих к повышению или понижению активностей определенных генов, ассоциированных с различными метаболическими процессами, включая регуляцию биогенеза рибосом и трансляции, на уровне транскриптома. Показано, что в наборе генов, чья экспрессия изменяется в ответ на дефицит eL29, присутствуют гены-мишени транскрипционных факторов p53 и c-Myc, что указывает на возможную связь между дисбалансом eL29 и онкогенезом, а в набор генов, чья экспрессия чувствительна к уровню eL38, входят гены, ассоциированные с остеогенезом (Gopanenko et al., 2020b; 2021a).
• Исследовано влияние клеточного дефицита рибосомного белка eL38 на экспрессию генов на уровне трансляции. Показано, что трансляционные эффективности генов, имеющих отношение к таким метаболическим процессам, как трансляция, сворачивание белков, организация хромосом и сплайсинг, повышались при снижении содержания eL38 в клетках, а генов, ассоциированных с регуляцией транскрипции, в том числе с активацией Hox-генов, связанных с регуляцией развития разных частей тела у животных, понижались (Gopanenko et al. 2021b).

3. С использованием методов электронного парамагнитного резонанса выявлены особенности лабильных комплексов 40S субчастиц рибосом человека с мРНК, соответствующих комплексам, образующимся при проверке качества транслируемых мРНК пептидом 55-64 белка uS3, и определены различия в конформациях мРНК в рибосомном канале между комплексами, имитирующими состояния рибосом в процессе трансляции.

• Измерено расстояние между участком входа в мРНК-связывающий канал 40S субчастицы и регионом, соответствующим лабильному связыванию мРНК, которое имеет место при её проверке на наличие АР сайта, и показано, что это связывание не зависит от занятости этого канала транслируемой мРНК (Malygin et al., 2019).
• Установлено, что мРНК находится в двух альтернативных конформациях в рибосомных комплексах, образующихся в процессе трансляции, соотношение между которыми различается в пост-транслокационных, пре-транслокационных и терминационных комплексах, и что мРНК не подвергается существенным конформационным изменениям в рибосомном канале в ходе завершения трансляции (Bulygin et al., 2021).

Базовые проекты

• ПФНИ ГАН (2013-2023), VI.57, проект №121031300041-4) «Системы репарации и трансляции и их роль в поддержании стабильности генома, долголетии и предотвращении онкозаболеваний и нейродегенерации. Патологические процессы, связанные с этими системами».

Гранты Российского научного фонда

• № 19-14-00072 «Исследование роли рибосомных белков, ассоциированных с заболеваниями человека, в регуляции экспрессии генов на уровне трансляции» 2019-2021 гг.
• № 22-14-00039 «Исследование эффектов изменений уровней рибосомных белков, ассоциированных с гепатоцeллюлярной карциномой, на экспрессию генов в клетках человека и анализ их белковых партнеров»

Гранты Российского фонда фундаментальных исследований

• № 19-04-00098 А «Функциональная роль рибосомного белка uS3 в контроле качества нуклеиновых кислот» (2019 -2021 гг.)
  
• № 20-04-00400 А «Трансляционная роль белков – компонентов функциональных центров рибосом млекопитающих на уровне отдельных структурных мотивов, участвующих в формировании этих центров» (2020-2022 гг.)

1. Two “Edges” in Our Knowledge on the Functions of Ribosomal Proteins: The Revealed Contributions of Their Regions to Translation Mechanisms and the Issues of Their Extracellular Transport by Exosomes. Ochkasova A., Arbuzov G.D., Malygin A.A., Graifer D.M. Int. J. Mol. Sci. 2023. V. 24. P. 11458. DOI: 10.3390/ijms241411458
2. Many Faces of Next-Generation Sequencing in Gene Expression Studies Malygin A.A. Int. J. Mol. Sci. 2023. V. 24. N 4. P. 4075. DOI: 10.3390/ijms24044075
3. Mutation at the Site of Hydroxylation in the Ribosomal Protein uL15 (RPL27a) Causes Specific Changes in the Repertoire of mRNAs Translated in Mammalian Cells. Zolotenkova E.A., Gopanenko A.V., Tupikin A.E., Kabilov M.R., Malygin A.A. Int. J. Mol. Sci. 2023. V. 24. N 7. P. 6173. DOI: 10.3390/ijms24076173
4. AP lyase activity of the human ribosomal protein uS3: The DNA cleavage sequence specificity and the location of the enzyme active center. Ochkasova A., Arbuzov G.D., Kabilov M.R., Tupikin A.E., Karpova G.G., Graifer D.M. Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 2023. V. 1871. N 2. P. 140880. DOI: 10.1016/j.bbapap.2022.140880
5. Changes in the Transcriptome Caused by Mutations in the Ribosomal Protein uS10 Associated with a Predisposition to Colorectal Cancer. Tian Y., Babaylova E.S., Gopanenko A.V., Tupikin A.E., Kabilov M.R., Malygin A.A., Karpova G.G. Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. N 11. P. 6174. DOI: 10.3390/ijms23116174
6. Reorganization of the Landscape of Translated mRNAs in NSUN2-Deficient Cells and Specific Features of NSUN2 Target mRNAs. Kossinova O.A., Gopanenko A.V., Babaylova E.S., Tupikin A.E., Kabilov M.R., Malygin A.A., Karpova G.G. Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23 N 17. P. 9740. DOI: 10.3390/ijms23179740
7. The functional role of the eukaryote-specific motif YxxPKxYxK of the human ribosomal protein eS26 in translation. Bulygin K.N., Malygin A.A., Graifer D.M., Karpova G.G. Biochim. Biophys. Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 2022. V. 1865. N 6. P. 194842. DOI: 10.1016/j.bbagrm.2022.194842
8. Eukaryotic protein uS19: A component of the decoding site of ribosomes and a player in human diseases. Graifer D.M., Karpova G.G. Biochem J. 2021. V. 478. N 5. P. 997-1008. DOI: 10.1042/BCJ20200950
9. Knockdown of the mRNA encoding the ribosomal protein eL38 in mammalian cells causes a substantial reorganization of genomic transcription. Gopanenko A.V., Kolobova A.V., Meschaninova M.I., Venyaminova A.G., Tupikin A.E., Kabilov M.R., Malygin A.A., Karpova G.G. Biochimie. 2021. V. 184. P. 132-142. DOI: 10.1016/j.biochi.2021.02.017
10. Two alternative conformations of mRNA in the human ribosome during elongation and termination of translation as revealed by EPR spectroscopy. Bulygin K.N., Timofeev I.O., Malygin A.A., Graifer D.M., Meschaninova M.I., Venyaminova A.G., Babaylova E.S., Fedin M.V., Frolova L.Y., Karpova G.G., Bagryanskaya E.G. Comput Struct Biotechnol J. 2021. V. 19. P. 4702-4710. DOI: 10.1016/j.csbj.2021.08.024
11. Knockdown of the Ribosomal Protein eL38 in HEK293 Cells Changes the Translational Efficiency of Specific Genes. Gopanenko A.V., Kolobova A.V., Tupikin A.E., Kabilov M.R., Malygin A.A., Karpova G.G. Int. J. Mol. Sci. 2021. V. 22. N 9. P. 4531. DOI: 10.3390/ijms22094531
12. AP sites in various mRNA positions cross-link to the protein uS3 in the translating mammalian ribosome. Ochkasova A., Meschaninova M.I., Venyaminova A.G., Graifer D.M., Karpova G.G. Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 2021. V. 1869. N 10. P. 140698. DOI: 10.1016/j.bbapap.2021.140698
13. Mild phenotype of knockouts of the major apurinic/apyrimidinic endonuclease APEX1 in a non-cancer human cell line. Kim D.V., Kulishova L.M., Torgasheva N.A., Melentyev V.S., Dianov G.L., Medvedev S.P., Zakiyan S.M., Zharkov D.O. PloS ONE. 2021. V. 16. N 9. P. e0257473. DOI: 10.1371/journal.pone.0257473
14. Deficiency of the ribosomal protein uL5 leads to significant re-arrangements of the transcriptional and translational land-scapes in mammalian cells. Babaylova E.S., Gopanenko A.V., Tupikin A.E., Kabilov M.R., Malygin A.A., Karpova G.G. Int. J. Mol. Sci. 2021. V. 22. N 24. P. 13485. DOI: 10.3390/ijms222413485

• препаративная центрифуга Avanti J30I (Beckman Coulter);
• настольные центрифуги Eppendorf 5415C, 5430R и miniSpin;
• вакуумный концентратор с центрифугой UNIVAPO;
• высокоэффективный жидкостной хроматограф Милихром А-02 (Эконова);
• источники питания и приборы для гель-электрофореза нуклеиновых кислот и белков;
• системы дозированного УФ-облучения Spotcure (UVP) и Bio-Link (Vilber);
• ПЦР-амплификаторы T100 и MJ MINI (Bio Rad);
• ПЦР-амплификатор для проведения анализа в режиме реального времени LightCycler 96 (Roche).